הומאוסטזיס ברמה מולקולריתמפת האתרעל האתרעקרונותספריהאאוקריוטיםפרוקריוטים?מוכנים  
*

פרוקריוטים

רקע עיוני למעבדה הוירטואלית

גידול חיידקים
החיידק E. coli, ובקרת ביטוי גנים.
גידול מעריכי
מדידת פעילות אנזימתית.
ספירת חיידקים


גידול חיידקים:
במעבדה וירטואלית זו תוכלו לבדוק השפעות כמו: סוג המצע או טמפרטורה או רמת pH על קצב גידול חיידקים.
לכן עלינו להכיר שיטות לגידול חיידקים, הרכבי מצעי מזון שונים, שיטות לספירת חיידקים ושיטות למדידת ביטוי של גנים.
על גידול והתרבות חיידקים תוכלו ללמוד בפרק הבסיס בנושא מיקרוביולוגיה שבאתר.

מצעי מזון ותנאי גידול:
למטרות שימושיות נוכל לחלק את מצעי המזון ותנאי הגידול לחיידקים לפי מספר אופנים:

  1. מצעי גידול מוצקים המאפשרים גידול של מושבות חיידקים.
     
                תמונה של צלחת פטרי.
    גידול חיידקים במצע מזון מוצק

  2. מצעי גידול נוזליים המאפשרים גידול חיידקים בתרחיף.
     
                תמונה של ארלנמייר.
    גידול חיידקים במצע מזון נוזלי
  3. מצעי גידול המכילים תרכובות אורגניות .
  4. מצעי מזון שאינם מכילים תרכובות אורגניות.
  5. מצעי מזון בררנים , המכילים גורם המאפשר רק את גידולם של חיידקים מסוימים בנוכחות אותו גורם. הגורם עשוי להיות פיזיקלי כמו טמפרטורה או קרינה או גורם כימי כמו תוספת חומר אנטיביוטי.


חיידקי E. coli , ובקרת ביטוי גנים:
רוב המידע הגנטי נמצא בחיידק הפשוט E. coli על כרומוזום מעגלי שארכו 1.5 מ"מ. מעט מידע גנטי קיים על פלסמיד אשר מידותיו קטנות מאוד ביחס לכרומוזום.
בקרת ביטוי גנים ניתוח כמותי:
ישנם גנים שמופעלים בתא תמיד כמו הגנים ליצירת רנ"א ריבוזומלי ישנם גנים המתבטאים רק בשילוב של תנאים מסוימים בתא אלו גנים המופעלים בתאים עם בקרת תעתוק.
במעבדה נגדל חיידקי E. coli בטמפרטורות מסוימות כפי שתבחרו, ב- pH מסוים שתבחרו ועל מצעי מזון המכילים מקורות פחמן גלוקוז ואו לקטוז.
לזן הבר של החיידק E. coli פעילות אנזים β גלקטוזידאז נמוכה כל עוד לא נוסף למצע המזון לקטוז.
בחיידק המוטנט מסוג: lacZ- אין פעילות של האנזים בטא גלקטוזידאז בשל מוטציה בגן וחוסר פעילותו גם אם למצע נוסף לקטוז. הגן lacZ מקודד לאנזים בטא גלקטוזידאז. מוטציה בגן משפיעה על פעילות החלבון.
החיידק המוטנט lacY- עבר מוטציה בגן lacY . הגן מקודד לחלבון ממברנלי המאפשר לסוכר ההדרופילי לקטוז לחדור לתוך התא.
קיימים חומרים דמויי סובסטראט, אנלוגים לסוכר לקטוז. האנלוג OPTG אינו חודר לתא החיידק, פירוקו ע"י האנזים β גלקטוזידאז יוצר תוצר צבעוני. החומר IPTG הוא אנלוג לגלקטוז ואינו מפורק ע"י האנזים בטא גלקטוזידאז. IPTG הוא משרן הנקשר לדכאן ומונע קישורו לדנ"א. IPTG מכיל קבוצה הידרופובית ולכן חודר לתא לא באמצעות נשא .



גידול מעריכי:
כאשר יצורים מתרבים באחוז קבוע לאורך זמן מסוים. הזמן הדרוש להכפלת מספר הפרטים הוא קבוע. לדוגמא אם אוכלוסיית חיידקים מוכפלת כל 30 דקות, קצב הגידול נשאר קבוע ובתוך 30 דקות נוספות מספר החיידקים יוכפל שוב.
מה קורה כאשר הגידול מתרחש בסביבה מוגבלת מבחינת המשאבים ?
במקרה זה נדון בסוג של חיידק המתרבה בדרך של השתנצות. מחיידק אחד מקבלים שניים ומשניים ארבע וכו'. כדי לפשט את הדוגמא נניח שזמן החלוקה הוא דקה אחת. זהו אם כן גידול קבוע. מספר החיידקים במערכת גדל באופן מעריכי. נקודה לחשיבה: אם זמן ההכפלה של חיידק הוא דקה אחת, ובזמן 0 הוספנו חיידק אחד בכלי גידול בתנאים מיטביים, בתנאים אלה, הכלי יתמלא בחיידקים כעבור 60 דקות. שימו לב, במערכת זו לאחר 59 דקות יהיו מחצית מספר החיידקים. חישבו וחשבו איך זה יתכן?
גידול מתמשך והכפלה חוזרת מובילים למספרים ענקיים. תאור גרפי של מספרים אלו אפשרי באמצעות מערכת צירים חצי לוגריתמית. ציר ה- X מתאר מרווחי זמן שווים וציר ה- Y מתאר את מספרי החיידקים במרווחים לוגריתמיים המאפשרים לבנות ציר המכיל מספרים קטנים וגדולים.
ראו עקום גידול בפרק הבסיס מיקרוביולוגיה שבאתר.

הצריכה של משאב מתכלה במערכת סגורה כמו תרבית חיידקים, אינו מאפשר גידול מעריכי אינסופי. כשהמשאב הופך נדיר יותר קצב הספקתו יורד וקצב הגידול משתנה בהתאם. ראה בעקום את שלב הגידול היציב.



מדידת פעילות אנזימתית, רקע כללי:
כדי למדוד פעילות גנים הנתונים תחת בקרה בתא ניתן לבדוק את הפעילות של התוצר החלבוני המתקבל. בזמן ביטוי הגנים של אופרון הלקטוז, אפשר למדוד את פעילות האנזים β גלקטוזידאז.
כדי למדוד פעילות אנזימתית עלינו להבין רקע כללי על מבנה ופעילות אנזימים:
מידע על כך תוכלו למצוא בפרק הבסיס מבנה התא וחילוף חומרים.

מדידת קצב פעילות אנזים מבוססות על מדידת קצב העלמות מגיב ואו קצב יצירת תוצר. צריך למצוא שיטה ייחודית למדוד כמותית את אחד מהגורמים.
מדידת פעילות ספציפית של אנזים מסוים מבוססת על שיטה ייחודית המתאימה לאנזים המסוים. למשל, מדידת הפעילות ספציפית הייחודית של האנזים β גלקטוזידאז, נעשית באמצעות חומר דמויי סובסטרט (אנלוג) שנקשר לאנזים ועובר פירוק. תוצר תהליך הפירוק צבעוני וניתן למדוד בליעת אור באורך גל מתאים. למעשה מודדים את קצב יצירת תוצר הפירוק של האנלוג.
מדידת פעילות ספציפית של אנזים מסוים מבוססת על שיטה ייחודית המתאימה לאנזים זה. מדידת פעילות האנזים β גלקטוזידאז, נעשית באמצעות אנלוג ללקטוז
(ONPG) O-nitrophenyl -β-D-galactopyranosid המתפרק ע"י האנזים לתוצר הבולע אור באורך גל של 420nm (צבע צהוב). האנלוג ONPG איננו חודר לתא החיידק, לכן שימוש באנלוג זה מחייב שינויי בחדירות קרום החיידק. האנלוג ONPG מתפקד רק כמצע אנלוגי של לאנזים ולא כמשרן של אופרון הלקטוז.
בבדיקת הפעילות האנזימתית נלקחת דגימה מתרבית החיידקים, לדגימה מוסיפים דטרגנט וכלורופורם כדי להרוס את קרום תא החיידק ולאפשר לאנלוג להגיע לאנזים. שימוש בחומרים אלו אינו פוגע בפעילות האנזים. ממתינים עד שהדגימה משנה את ציבעה ומפסיקים את התגובה ע"י תוספת בסיס, ב- pH בסיסי האנזים מפסיק לעבוד. מודדים בליעה בעזרת מכשיר ספקטרופוטומר באורך גל של 420nm.
פעילות האנזים מחושבת: בליעה ב- 420nm ביחידות: צפיפות אופטית OD זמן התגובה לקבלת צבע צהוב.

ספקטרופוטומטר

ספירת חיידקים:
כאשר מגדלים חיידקים במצע גידול מוגדר, בתנאים מוגדרים בנפח נתון ידוע. שינוי במספר החיידקים לאורך זמן מהווה מדד לקצב גידולם.
כדי לספור חיידקים נוציא דגימה בנפח ידוע כל פרק זמן מסוים, מתרבית הגידול ונבצע ספירת חיידקים.
ניתן לחלק את שיטות הספירה ל:
  1. ספירה כללית, מספר החיידקים הכולל בדגימה חיידקים חיים + מתים שיטה מהירה הנותנת מדד בלבד.
  2. ספירה חיה, מספר החיידקים החיים בלבד בתרבית הגידול. הדגימה עוברת מספר טיפולים לפני הספירה ולכן שיטה איטית יותר, אך נותנת מדד מדויק.
ספירה כללית מתבצעת על-ידי מדידת העכירות של תרבית במצע גידול נוזלי. העכירות מהווה מדד למספר החיידקים הכולל בתרבית. העכירות נמדדת באמצעות מכשיר המודד נפיצות אור. ככל שיש יותר חלקיקים נפיצות האור עולה. שיטה נוספת לבצע ספירה כללית של חיידקים מבוססת על בליעת אור באורך גל מסוים הנמדד על-ידי ספקרופוטומטר.
ספירה חיה מתבצעת במספר דרכים: צביעה סלקטיבית של חיידקים מתים על-ידי צבע החודר לחיידקים מתים בלבד וספירת דגימה בנפח ידוע מתחת לעדשת המיקרוסקופ. ואו זריעת בידוד של הדגימה וספירת מספר המושבות המתקבלות רק מהתרבות החיידקים חיים. את תוצאות הספירה ניתן לרכז בטבלה ולשרטט עקום גידול של החיידקים בתנאים המוגדרים.
הסברים נוספים תוכלו למצוא בשיטות מעבדה (באנגלית).


המעבדה הוירטואלית: רקע עיוני | למעבדה | הנחיות לכתיבת דוח מעבדה | יש שאלות ? אנחנו עונים!




 
חזרה

מוכנים?
| פרוקריוטים | אאוקריוטים | ספריה | עקרונות | על האתר | מפת האתר | לדף הראשי


כל הזכויות שמורות © 2002, משרד החינוך
האתר נבנה בידי סנונית